自然杀伤(NK)细胞在肿瘤治疗中被广泛认为比T细胞更为安全可靠。针对CD19靶点的嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞已证明在淋巴B细胞肿瘤患者的治疗中表现出显著的安全性与有效性。然而，CAR-NK细胞的制造过程相当复杂，且费用高昂。因此，本研究采用了一种名为“别针”(Pin)技术的非基因修改方法来生产抗肿瘤NK细胞。这一方法利用脐血来源的单个核细胞(PBMCs)与细胞因子IL-2/IL-15，结合转染了爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)的B淋巴母细胞滋养层细胞来生成NK细胞，并对改良后的抗CD20和抗CD19抗体进行孵育扩增。最终产生的NK细胞在CD16a表面附带有抗CD19/CD20的抗体，从而通过抗体依赖性细胞毒性增强其对CD19或CD20阳性肿瘤细胞的杀伤能力，达到类似CAR-NK细胞的治疗效果。

别针单抗的生产和纯化通过对人类IgG1的Fc的CH2结构域进行四个氨基酸的改造：S239D/H268F/S324T/I332E，所有别针抗体均由RD-Biotech（Besançon, France）生产，采用CHO细胞合成并通过蛋白A纯化。具体而言，别针-CD20单抗的抗原结合域来自利妥昔单抗，而别针-HER2单抗及别针-EGFR单抗则分别来自曲妥珠单抗与西妥昔单抗。此外，别针-CD19单抗的抗原结合域则源于布纳吐莫单抗。

细胞K562、Daudi、Toledo、Raji、MOLM-13、Namalwa、Ramos、Karpas、TDM8、SUDHL-10、SUDHL-6和SUDHL-4均购自ATCC或ECACC，所有悬浮细胞在含10% FBS的RPMI-1640 GlutaMAX培养基中进行培养。HCT116、MDA-MB-468、MCF7细胞则在含10% FBS的DMEM高糖培养基中培养。淋巴瘤细胞患者样本来源于蒙彼利埃CHU的CRB-CHUM平台。

抗体定量细胞系及患者样本中的CD19和CD20绝对值由BD藻红蛋白PE荧光定量试剂盒（BD Biosciences）和BDFACSCantoII流式细胞仪进行定量检测。在体外扩增NK细胞（eNK细胞生产）时，采用EasySep人类CD3阳性分选试剂盒II（STEMCELL）从脐血单个核细胞（UCBMCs）中去除CD3阳性细胞，其余UCBMCs则在含10% FBS（RPMI-1640）或5%人类血清（NKMACS）的培养基中培养，并额外添加IL-2和IL-15。在培养至Day5至Day7时，每2-3天全量更换新鲜培养基，确保NK细胞密度至少在06×106个细胞/mL。在培养结束时，加入70Gy处理的EBV转染B淋巴母细胞作为滋养层细胞，进行适当比例的孵育。

经过培养扩增的2×105个拓展后NK细胞（eNK）经过流式细胞术检测其标志物的表达，如CD56、CD45、CD57等。随后，通过Muse细胞分析仪（CYTEK）对eNK细胞进行计数，并在含10μg/mL别针-CD20/CD19/EGFR/HER2单抗的RPMI-1640 GlutaMAX培养基中重悬。细胞毒性实验中，eNK或别针单抗包裹的eNK与CFSE标记或CellTraceFarRed标记的靶细胞按照特定的E:T比混合，并在96孔板中共培养24小时，利用流式细胞术检测靶细胞的杀伤情况。对照组则由健康贡献者PBMCs来源的eNK或别针-CD20 eNK在E:T=1:1的环境下孵育16小时后进行测试。

体内细胞毒性实验采用从IGMM购买的NSG小鼠进行，10周龄雌性NSG小鼠分别腹腔注射别针注射的eNK、别针-CD20 eNK及别针-CD19 eNK，并加入荧光标记的Nalm6、Raji或Daudi细胞。4小时后处死小鼠，收集腹水细胞并去除红细胞后进行流式细胞术分析eNK细胞的存活和细胞毒性能力。

在小鼠体内白血病模型中，将0.2×105个Raji细胞静脉注射至CB17SCID小鼠体内。在肿瘤细胞注射后第4天和第8天，分别腹腔注射30×106个eNK或别针-CD20 eNK，对照组注射纯PBS。在第11、14、17天静脉注射IL-15。第27天处死小鼠并收集肺、骨髓、血液，使用流式细胞术检测Raji细胞在各组织中的占比。

在体外与体内实验中，eNK及别针-CD20抗体显示出良好的组装稳定性。通过对脐血来源单个核细胞进行IL-2/IL-15刺激与滋养层细胞的加入，配合培养方案成功获得了具有完整细胞毒性和高纯度的eNK。eNK细胞表现出正常的抑制性受体与激活型受体表达。通过对单抗改造形成别针单抗，增强其对CD16a的亲和力，最终生成别针单抗eNK，而80%的eNK能够有效结合别针抗体，显示出与普通利妥昔单抗的不一样的结合稳定性。

实验表明，别针-CD20 eNK在体内有效消除CD20阳性的靶细胞。临床应用中，正常健康贡献者PBMCs来源的别针-CD20 eNK能够选择性清除B细胞，对其他免疫细胞则不会造成伤害。此外，在与注射有Daudi细胞的NSG小鼠进行的抗肿瘤实验中，仅有别针-CD20 eNK能够有效清除肝脏中的肿瘤细胞，且减少了肿瘤细胞在其他器官中的积累。

CD19作为另一种更普遍的靶标，在CAR-T和CAR-NK疗法中具有重要应用潜力，尤其是在患者肿瘤细胞CD20下调或对利妥昔单抗产生耐药性时。通过别针CD20-eNK和别针CD19-eNK的联合应用，针对套细胞淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤的原发性患者肿瘤细胞测试证明，别针-CD20-eNK与别针-CD19-eNK在清除肿瘤细胞表现出更高的效力，展现了双重别针武装的eNK在临床应用的巨大潜力。通过对抗体的氨基酸替换增强自然杀伤(NK)细胞对抗肿瘤细胞的亲和力，成功实现了NK细胞的靶向治疗效果，且该方法不涉及基因修饰，展现出极强的应用前景。

人生就是博-尊龙凯时，这种创新的治疗手段为未来的肿瘤治疗带来了新的希望，结合现代生物技术与临床应用前景，为全球抗击肿瘤提供了有力的支持。