第一章：分子克隆实验概述

分子克隆技术是生物医疗领域常用的一种实验方法，研究者可以利用该技术将DNA片段通过体外重组的方式构建至载体中。随后，经过转化操作，将重组载体导入合适的宿主细胞中进行复制和扩增，最终筛选出符合实验需求的载体克隆。

一、分子克隆实验方法

分子克隆研究通常需要将特定的DNA片段插入至载体，形成重组质粒。根据实验目的的不同，分子克隆技术主要可以分为以下几类：

• 入门克隆：TA克隆、TOPO克隆。
• 定向克隆：同源重组、酶切连接（包含黏性末端双酶切反应）。
• 定点突变：包括碱基的插入、缺失与改变。

1. 酶切连接

酶切连接是载体构建实验中最为经典的技术，利用限制性内切酶（专指Type II型限制性内切酶）与T4 DNA连接酶，完成DNA片段与载体的重组。限制性内切酶被分为四类，Type II型限制性内切酶能够识别特定的双链DNA序列，并在识别序列内或其附近切割，水解核苷酸链中的磷酸二酯键，从而生成所需的特定DNA片段。

T4 DNA连接酶则可以催化相邻的5’磷酸基团和3’羟基末端生成磷酸二酯键。在使用酶切连接构建载体时，必须分析载体与DNA片段上的酶切位点，确保它们用相同的限制性内切酶进行消化，避免插入片段内部包含酶切位点的问题。

通过PCR方法在目的片段的两端引入酶切位点后，使用限制性内切酶对质粒/载体和扩增片段进行消化，得到一致的酶切产物并加以纯化，随后使用T4 DNA连接酶对其进行连接，经过感受态细胞转化和筛选便能最终获得重组质粒。

2. TA克隆

TA克隆是一种将PCR片段与具有3’-T突出序列的载体连接的技术，最终得到重组质粒。该方法利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性，在双链PCR产物的3’末端添加一个"A"碱基，同样可以与经过特殊处理后具有3’-T突出的线性化载体通过T/A配对结合。尽管这种方法快速且高效，但对于平末端产物的连接则不具兼容性。

3. TOPO克隆

TOPO克隆技术依赖拓扑异构酶的催化作用，将目的片段与线性载体连接。该技术的核心是DNA拓扑异构酶I，具有同时作为限制性内切酶和连接酶的双重功能，并且能够在短时间内高效完成连接。拓扑异构酶通过切割一条DNA链与3’端的磷酸基团形成共价键，从而开启解旋过程，使线性化DNA片段的5’羟基端形成新键，与载体DNA连接。

4. 同源重组

同源重组是利用重组酶将具有末端序列一致的两段DNA进行重组，形成环形双链DNA。该方法要求在扩增插入片段时，通过PCR引物的5’端引入15-20bp的同源序列，以确保插入片段与线性化质粒载体末端序列完全匹配。此后，利用Vazyme的ClonExpress同源重组系列核心酶进行重组，具有快速高效、无酶切和连接等优点。

5. 定点突变

定点突变技术用于向特定DNA片段（如质粒）引入所需的碱基变化，包括碱基的插入、缺失与变化。传统定点突变系统利用反向互补引物对质粒进行PCR扩增，并在引物中设置突变位点，但存在较大模板需求和假阳性风险。相较之下，MutExpress（Vazyme）点突变系统依据ClonExpress快速克隆技术，使用部分反向互补的引物进行高效的PCR扩增，并得到高成功率的突变结果。

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